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一文詳解2019諾獎研究:低氧信號機制的發現有多重要

2019年10月14日來源:知識分子 作者: 提供人:renshen76......
一文詳解2019諾獎研究:低氧信號機制的發現有多重要

撰文:郭曉強

氧氣是絕大多數高等生物所必需物質,然而生命為適應低氧環境而進化出一個保守的低氧信號應答機制,通過感知氧含量而啟動不同應答。低氧信號機制的闡明一方面深化對多種生理現象的理解和認識,另一方面也為相關疾病治療提供全新策略。

氧(oxygen,O)是地殼中含量最多的元素,基本以氧化物(含有氧的化合物)形式存在;而兩個氧原子構成的氧分子(O2)則是大氣基本成分之一,對于地球上大多數生物尤其是高等生物而言具有必不可少的作用。然而,氧對生命而言具有雙刃劍作用,一方面不可或缺,因為大部分生命每時每刻的能量代謝和其他生理過程都依賴氧的參與;另一方面氧還具有損傷作用,氧化過程產生的自由基等副產物是危害健康重要因素之一。因此,氧的感知和調控就成為科學家關注的重要問題。

氧的發現和作用

盡管氧在自然界已存在上億年,但真正被認知并開始研究才僅二百多年歷史。十八世紀七十年代,英國化學家普里斯特利(Joseph Priestley)、瑞典化學家舍勒(Carl Wilhelm Scheele)以及法國化學家拉瓦錫(Antoine Laurent Lavoisier)幾乎同時發現氧的存在,特別是拉瓦錫還對氧的作用進行了科學闡述,提出燃燒本質是物質與氧的反應,擯棄了當時主流的“燃素說”,從而極大推動化學的快速發展。拉瓦錫還做出另一項重大貢獻,在嚴格實驗數據基礎上提出生物呼吸過程與物質燃燒在本質上類似,這一重要論斷標志著生物氧化(早期也稱為生物燃燒)領域的誕生。

二十世紀,氧在生命過程中的作用和機制得到全面闡述。氧的歸宿就是生成氧化物,該過程又可分為兩種類型。一種是營養物質(如葡萄糖、脂肪酸等)的氧化過程,該過程往往伴隨能量產生(包括ATP生成和熱量釋放),參與酶被稱為氧化酶(或還原酶)。另一類為非直接供能的物質(如代謝廢物、毒物等)的加氧過程,該過程主要為增加物質溶解性,進而有利于排泄,參與酶稱為加氧酶,此外部分生物大分子(如DNA和蛋白質等)也存在這一過程,其目的在于影響生物分子結構和活性。總之,這些研究清晰表明氧對生命具有至關重要的意義。

紅細胞生成素和低氧誘導因子

氧的重要性意味著生命無法長期隔離氧氣,但機體在特殊情況(如高原環境和短時期窒息等)時會面臨氧供應不足(低氧)狀況,如何適應就成為生物體必須解決的重大問題。

二十世紀六十年代,科學家發現低氧環境下機體內紅細胞數量會急劇增加,以增加對氧的攜帶和運輸能力,從而達到緩解機體缺氧狀況。深入研究發現這是源于低氧可增加促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)含量,EPO不僅成為第一個明確的低氧誘導分子,而且人重組EPO還被廣泛應用于貧血等疾病的治療。

EPO的發現和應用同時也提出一個基本科學問題,那就是EPO在低氧環境下的調控機制。1977年人EPO蛋白被純化成功,1985年人EPO基因也被成功克隆,這些進展為進一步機制研究奠定堅實基礎。不久,美國約翰霍普金斯大學遺傳學家西門扎(Gregg L. Semenza)開始嘗試解決這一問題。

西門扎背景是兒科學和醫學遺傳學,最初研究方向是地中海貧血的發病原因。西門扎在研究過程中無意間接觸到EPO,從而從根本上改變了研究方向。西門扎和同事將人的EPO基因轉入小鼠體內,制備出的轉基因小鼠可生成更多紅細胞。這一結果說明人的EPO基因不僅可在小鼠體內表達,而且還可發揮正常的從紅細胞生成功能。

在此基礎上,西門扎決定進一步研究EPO的表達調控。1992年,西門扎和學生在EPO調控區(非編碼蛋白序列)鑒定出一段與低氧誘導相關的保守DNA序列,將這段序列連接到非低氧誘導基因后,可引起這些基因表達也受低氧調控,這一序列后被命名低氧應答元件(hypoxia response element, HRE)[1]。西門扎推測由于HRE是一段DNA序列,因此理論上還存在對應的特異因子,該因子可在細胞核內與HRE結合并增加基因表達。為驗證該假說,西門扎從低氧處理后的細胞核提取物中分離并純化得到一種蛋白質,該蛋白質可與HRE特異結合。特別是該蛋白質只在低氧環境下穩定存在,常氧時蛋白質幾近消失,鑒于這種特性而將其命名為低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)[2]。對HIF-1組成分析發現其含有兩種亞基,分別命名為HIF-1α和HIF-1β,其中HIF-1β與前期發現的芳香烴受體核轉位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT) 相同,只有HIF-1α為新成分。在性質方面,HIF-1α蛋白含量受氧的嚴格調控,只存在于低氧環境下下,而HIF-1β蛋白為組成型,其含量與氧的濃度無關。

西門扎隨后發現,機體大部分組織都存在穩定的HIF-1α蛋白,然而EPO只在腎臟和肝臟中表達,這一事實表明HIF-1的作用應不局限于EPO調節。在這一思路指導下,西門扎小組鑒定出多種HIF-1調節的低氧誘導基因,包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter-1,GLUT1)。

HIF-1發現的意義在于說明低氧感知是一個非常重要的生物學過程,具有廣泛的生物學意義,從而吸引更多研究人員加入對這個問題的研究之中,極大推動了該領域的快速發展。HIF的發現證明其對低氧應答基因表達具有重要影響,然而仍有許多問題需要回答,首要問題是常氧環境下蛋白穩定性降低原因。此時一項看起來毫無關聯的研究為此提供了重要線索。

VHL與低氧誘導因子

1904年,德國眼科醫生馮?希佩爾(Eugen von Hippel)首次描述了一種眼血管瘤;1927年,瑞典病理學家林道(Arvid Vilhelm Lindau)則獨立描述了一種小腦和脊髓血管瘤。后來發現,兩位研究人員描述的其實是同一疾病,因此從60年代開始將這種疾病統一命名為馮?希佩爾-林道疾病(von Hippel-Lindau (VHL) disease)。VHL是一種遺傳性疾病,患者發生血管瘤、血管母細胞瘤和腎癌等幾率極大增加,并且這些腫瘤血管化現象尤其明顯,體內生成大量VEGF和EPO,這些特征預示著VHL可能與低氧有一定關聯。1993年,該病致病基因VHL被成功測序,發現其發生功能失活性突變,意味著VHL應為一種抑癌基因,這一進展為深入研究作用機制奠定堅實基礎。

美國分子生物學家凱林(William Kaelin)最初想法是成為一名臨床醫生,在約翰霍普金斯醫院完成實習和培訓后進入丹娜法伯癌癥研究院(Dana-Farber Cancer Institute)從事臨床腫瘤學研究。恰逢第一個抑癌基因RB鑒定成功,該基因突變可導致視網膜母細胞瘤發生,這一進展掀起了抑癌基因的尋找熱潮,原本對基礎研究幾無興趣的凱林也逐漸改變看法,經過一段時間實驗室系統培訓后于1992年開始自己的抑癌基因研究計劃,選擇對象是VHL突變相關的腎癌。

凱林決定研究VHL突變造成腎癌發生的機制。1996年,凱林與同事制備成功VHL突變細胞系,然后將其與VHL基因正常細胞進行比較。他們意外發現,VHL突變細胞即使在常氧情況下仍可大量表達低氧誘導基因如VEGF等,當為其轉入正常VHL基因后這種現象消失。凱林進一步研究發現VHL突變細胞之所以在常氧環境下表達低氧誘導基因是由于原本應降解的HIF-1α卻可以正常存在[3],這一結果說明VHL基因突變破壞了HIF-1α在常氧下的降解能力。

凱林的發現很好解釋了腎癌高度血管化的現象,然而提出一個新問題,即VHL蛋白在常氧環境下降解HIF-1α的機制。

VHL與泛素化

80年代末,英國牛津大學分子生物學家拉特克利夫(Sir Peter John Ratcliffe)也開始關注EPO表達調控機制,他專業背景為腎臟生理,而科研原動力來自于腎臟器官對氧的敏感性。拉特克利夫在90年代早期也發現了EPO中存在HRE,并對其調控作用進行了初步研究。拉特克利夫還發現肝癌細胞移植入小鼠體內成瘤后,在缺氧區出現大量低氧誘導基因如VEGFGLUT1等,當破壞HIF-1則使低氧誘導基因表達不在升高,并且腫瘤組織生長減緩。這些結果一方面證明了低氧信號通路廣泛的生物學作用,而且也與凱林腎癌的結果產生了密切聯系。

待HIF-1α和VHL先后發現后,拉特克利夫對二者之間的興趣產生了濃厚興趣。由于細胞內蛋白質降解需要通過溶酶體途徑或蛋白酶體途徑,而HIF-1α的降解模式更像蛋白酶體,后續研究也證明這一推測,故此開始考慮VHL在蛋白質泛素化過程中的作用。多項研究表明,VHL蛋白其實是泛素連接酶(E3)復合物的關鍵亞基,而拉特克利夫則進一步證明VHL蛋白可與HIF-1α相互作用進而在低氧環境下促進其泛素化和降解[4]。多家實驗室還在結構層面證實了拉特克利夫的發現,確定了VHL催化的HIF-1α泛素化是造成常氧環境下HIF-1α蛋白穩定性下降的主要原因。

拉特克利夫等的發現很好解釋了腎癌VHL基因突變后HIF-1α含量增加和低氧信號通路增強的問題,然而仍面臨一個亟待解決的重大問題,那就是細胞低氧感知和VHL啟動HIF-1α泛素化如何實現有機整合。

PHD與氧感知

靶蛋白進行泛素化修飾前往往先進行其他類型修飾以區分它與原蛋白差異,避免被錯誤降解,最常見的修飾為磷酸化,然而凱林和拉特克利夫發現抑制蛋白磷酸化過程并不影響HIF-1α常氧下降解速率,而減少鐵離子或氧含量則顯著增加HIF-1α穩定性,說明該修飾過程與鐵和氧相關。2011年,兩個小組采用類似策略,首先將泛素化途徑阻斷從而造成HIF-1α蛋白積累,進一步分析發現這些積累HIF-1α的脯氨酸(proline)存在羥基化修飾,當阻斷羥基化則破壞HIF-1α被VHL蛋白的識別和隨后的泛素化而使蛋白穩定性增加[5,6]。不久,拉特克利夫和同事進一步從果蠅中鑒定出一種雙加氧酶,其負責催化HIF-1α的羥基化[7]。哺乳動物也存在雙加氧酶,稱為脯氨酰羥化酶結構域蛋白(prolyl hydroxylase domain, PHD),共包含3個成員,分別為PHD1、PHD2和PHD3。PHD酶活性受O2、Fe2+、維生素C和α-酮戊二酸等的影響,這一發現的意義在于為調控PHD酶活性提供重要思路。至此,低氧信號通路基本組分被鑒定完畢。

三位科學家和低氧信號

復雜的低氧信號通路

三位科學家的研究奠定了低氧信號通路基本框架,后續大量研究進一步拓展了這一過程的詳細分子途徑。

首先,低氧信號通路存在更多中介分子。目前,在人類中共發現三種HIF-α,分別為HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α,兩種HIF-β,分別為HIF-1β和HIF-2β,采用不同組合可形成多種異源二聚體,從而使低氧應答機制更加豐富多樣化。除PHD受氧調節外,還鑒定出另一種羥基化酶FIH(factor inhibiting HIF,FIH),其催化的HIF-α羥基化并不影響HIF-α蛋白穩定性,而是阻礙其與轉錄共激活蛋白結合,從而造成轉錄激活效應降低。因此,常氧情況下HIF-α的兩種羥基化修飾可實現蛋白含量和轉錄活性雙重抑制,從而保證低氧誘導基因只能嚴格在低氧環境下表達[8]。此外,HIF復合物調節靶基因表達時還常需要其他元件(作為轉錄共激活蛋白發揮活性)參與,著名的如組蛋白乙酰轉移酶p300,我們最近研究表明多種組蛋白去甲基化酶如JMJD1A和JMJD3等也參與了低氧信號通路,從而更加深化對低氧適應機制的理解。

其次,低氧信號通路與其他信號通路存在復雜的互作,最著名的是mTOR信號通路。mTOR(mechanistic target of rapamycin)是一種蛋白激酶,可將環境脅迫信號如營養缺乏等于細胞內蛋白合成、脂類合成等實現有機整合。低氧信號通路和mTOR信號通路通過協調作用而實現細胞則惡劣生存環境下的適應。

研究意義

低氧信號通路的發現開創了一個全新研究領域,具有重要的理論價值和巨大的應用潛力。低氧信號通路闡明了機體在不利環境下的適應機制,包括低氧促進紅細胞生成增多、耗氧量降低等代償性效應以減少氧不足造成的機體損傷。低氧信號通路對一些組織氧化損傷和炎癥具有保護作用,如冠狀動脈疾病、外周動脈疾病、傷口愈合、器官移植排斥和結腸炎等。然而過度低氧信號也可導致機體損傷,包括遺傳性紅細胞增多癥、慢性缺血性心肌病和阻塞性睡眠呼吸暫停等[9]。特別是大多數固體腫瘤都存在低氧信號通路異常活化現象,并且與患者預后呈負相關。低氧信號通路通過增加營養物質如葡萄糖攝取、血管生成等策略最終促進了癌細胞的增殖和轉移。

低氧信號通路的關鍵元件還成為疾病治療重要靶點,從而為多種疾病治療提供新策略。PHD抑制劑可有效穩定HIF-α蛋白穩定性,進而增加低氧靶基因表達,這一策略可應用于治療貧血、缺氧引起的組織損傷等。抑制低氧信號通路則在癌癥治療方面顯示出巨大價值。以腎癌為例,腎癌是低氧效應最明顯腫瘤,因為VHL突變在腎癌中發生比例最高(達70%左右,其他腫瘤比例較低甚至缺乏),最早開發的VEGF抑制劑——貝伐單抗作用機制在于抑制血管形成以減降低癌細胞營養供應,而最近開發的特異性HIF-2α拮抗劑PT2399則在細胞、動物和臨床前實驗中顯示出較好的治療效果[10]。

總之,低氧信號通路的闡明極大拓展了生命科學和醫學的研究領域,其重要性也越來越多得到科學界的認可,三位科學家西門扎、凱林和拉特克利夫因此于2016年分享美國有“小諾貝爾獎”之稱的拉斯克基礎醫學獎(Albert Lasker Award for Basic Medical Research),此外還分享2010年加拿大的蓋爾德納國際獎(Gairdner International Award)等,隨著研究深入和臨床廣泛應用,三位科學家也有望將來分享諾貝爾生理學或醫學獎。

[本項目由河北自然科學基金(No H2014205082)資助]

(E-mail:[email protected]。)

[1] Semenza GL, Nejfelt MK, Chi SM, et al. Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer located 3' to the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(13):5680.

[2] Wang GL, Semenza GL. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem, 1995, 270(3): 1230.

[3] Iliopoulos O, Levy AP, Jiang C, et al. Negative regulation of hypoxia-inducible genes by the von Hippel-Lindau protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(20):10595.

[4] Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature, 1999, 399(6733):271.

[5] Ivan M, Kondo K, Yang H, et al. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2sensing.Science, 2001,292(5516):464.

[6] Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, et al. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science, 2001, 292(5516):468.

[7] Epstein AC, Gleadle JM, McNeill LA, et al. C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell, 2001, 107(1):43.

[8] Hurst JH. William Kaelin, Peter Ratcliffe, and Gregg Semenza receive the 2016 Albert Lasker Basic Medical Research Award. J Clin Invest, 2016, 126(10):3628.

[9] Ratcliffe PJ. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J Physiol, 2013,591(8):2027.

[10] Ricketts CJ, Crooks DR, Linehan WM. Targeting HIF2α in Clear-Cell Renal Cell Carcinoma. Cancer Cell, 2016, 30(4):515.

注:本文來自上海《科學》雜志,經授權轉載。

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